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細胞培養(yǎng)技術 (科學技術)和具體步驟

更新時間:2021-12-21  |  點擊率:1096

細胞培養(yǎng)技術指的是細胞在體外條件下的生長,在培養(yǎng)的過程中細胞不再形成組織(動物)。

培養(yǎng)物是單個細胞或細胞群。細胞在培養(yǎng)時都要生活在人工環(huán)境中,由于環(huán)境的改變,細胞的移動或受一些其他因素的影響,培養(yǎng)時間加長,傳代導致細胞出現(xiàn)單一化型。

優(yōu)點

1.直接觀察活細胞的形態(tài)結構和生命活動。用于細胞學、遺傳學、免疫學、實驗醫(yī)學和腫瘤學等多種學科研究.

2.直接觀察細胞的變化可便于攝影。

3.研究細胞種類如低等到高等到人類、胚胎到成體、正常組織到腫瘤。

4.便于使用各種技術:相差、熒光、電鏡、組化、同位素標記等方法觀察和研究細胞狀況。

5.是分子生物學和基因工程學的研究對象,也是其主要的組成部分。

6.易于施用物理、化學生物的實驗研究。

7.易于提供大量生物性狀相似的實驗對象,耗資少比較經(jīng)濟。

8.成為生物制品單克隆抗體生產(chǎn)和基因工程等的材料來源。

缺點

組織和細胞離體后獨立生存在人工的培養(yǎng)環(huán)境中,雖然模擬體內(nèi)環(huán)境,仍有很大差異。 因而利用培養(yǎng)細胞做實驗時,不應視為體內(nèi)細胞*相同,把實驗結果推測體內(nèi),輕易做出與體內(nèi)等同的結論。

具體步驟

1.細胞復蘇

將凍存細胞從液氮中取出后,在37℃水浴鍋內(nèi)不斷搖動促進其融化。將融化的細胞移入離心管中,加入37oC預熱的DMEM*培養(yǎng)基中(其中胎牛血清約為10%),輕輕吹勻,離心,500g離心2min,棄上清液。

加入DMEM*培養(yǎng)基清洗,棄上清液。加入DMEM*培養(yǎng)基,輕輕吹打混勻,制成細胞懸液,接種于培養(yǎng)皿/瓶中,在含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.細胞傳代

當細胞密度達到80%~90%(過早產(chǎn)量不足,過晚細胞狀態(tài)不佳,1:2至1:10以上的比率傳代培養(yǎng),一般1:3至1:5細胞一代,即從細胞接種到分離再培養(yǎng)的一段時間,非細胞有絲分裂次數(shù))時,去掉*培養(yǎng)基,用1X PBS清洗2次。

加入胰蛋白酶(注意:消化液的量以蓋住細胞最好,最佳消化溫度是37oC。顯微鏡下觀察細胞:倒置顯微鏡下觀察消化細胞,若胞質回縮,細胞之間不再連接成片,表明此時細胞消化適度)進行消化,放入細胞培養(yǎng)箱中約2-3min。

加入適量DMEM*培養(yǎng)基終止胰蛋白酶消化,轉移至離心管后500g離心2min,棄上清液,再加入DMEM*培養(yǎng)基清洗,棄上清液。

加入DMEM*培養(yǎng)基,輕輕吹打混勻,吸取10微升進行計數(shù),然后按照所需細胞量在含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

3.細胞凍存

當細胞密度達到80%~90%時,去掉*培養(yǎng)基,用1X PBS清洗2次。加入胰蛋白酶進行消化,放入細胞培養(yǎng)箱中約2-3min。加入DMEM*培養(yǎng)基終止胰蛋白酶消化,轉移至離心管后500g離心2min,棄上清液,再加入DMEM*培養(yǎng)基清洗,棄上清液。加入lml凍存液(90%胎牛血清,10% DMSO。 一般來講血清含量可以在10%-90%之間調整,凍存液中加入血清一方面可以為細胞提供營養(yǎng),另一方面可以在細胞凍存過程中提供非滲透性保護物質,如蔗糖,白蛋白等從而更好地保護細胞),放入凍存管內(nèi)(管內(nèi)有異丙醇,以保證溫度降低的速度),立即放入4oC冰箱中凍存30min,然后放入-20oC冰箱中凍存30min,再置于-80℃冰箱內(nèi)過夜。

第二天放入液氮中,可以保存至少兩年,如不放人液氮,可以保存三個月。

細胞凍存和復蘇的原則是:慢凍速融,這樣更加有利于保持細胞的活力。凍存細胞不加任何保護劑,會導致細胞內(nèi)冰晶的產(chǎn)生,從而使細胞產(chǎn)生內(nèi)源性的機械損傷,引起細胞內(nèi)環(huán)境滲透壓,PH,電解質等的改變,進而促使細胞死亡。


科研實驗中,細胞的體外培養(yǎng)一直是一個重要環(huán)節(jié)。細胞要養(yǎng)好,就要用好血清,如Ausbian®特級胎牛血清,它適合各種細胞培養(yǎng),尤其適合難養(yǎng)細胞,如:干細胞、肝細胞,神經(jīng)細胞,原代培養(yǎng)、細胞融合、轉染細胞等。


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