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細胞傳代培養(yǎng)方法(消化法)

更新時間:2022-01-24  |  點擊率:1226

具體操作:

(一)傳代前準備

1.預熱培養(yǎng)用液:把已經(jīng)配制好的裝有培養(yǎng)液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內(nèi)預熱。

2.用75%酒精擦拭經(jīng)過紫外線照射的超凈工作臺和雙手。

3.正確擺放使用的器械:保證足夠的操作空間,不僅便于操作而且可減少污染。

4.點燃酒精燈:注意火焰不能太小。

5.準備好將要使用的消毒后的空培養(yǎng)瓶,放入微波爐內(nèi)高火,8分鐘再次消毒。

6.取出預熱好的培養(yǎng)用液:取出已經(jīng)預熱好的培養(yǎng)用液,用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺內(nèi)。

7.從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細胞:注意取出細胞時要旋緊瓶蓋,用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺面,再在鏡下觀察細胞。

8.打開瓶口:將各瓶口一一打開,同時要在酒精燈上燒口消毒。

(二)胰蛋白酶消化

1.加入消化液:小心吸出舊培養(yǎng)液,用PBS清洗(沖洗),加入適量消化液(胰蛋白酶液),注意消化液的量以蓋住細胞最好,最佳消化溫度是37℃。

2.顯微鏡下觀察細胞:倒置顯微鏡下觀察消化細胞,若胞質(zhì)回縮,細胞之間不再連接成片,表明此時細胞消化適度。

3.吸棄消化液加入培養(yǎng)液:棄去胰蛋白酶液,注意更換吸管,加入新鮮的培養(yǎng)液。

(三)吹打分散細胞

1.吹打制懸:用滴管將已經(jīng)消化細胞吹打成細胞懸液。

2.吸細胞懸液入離心管:將細胞懸液吸入10ml離心管中。

3.平衡離心:平衡后將離心管放入臺式離心機中,以1000轉(zhuǎn)/分鐘離心6-8分鐘。

4.棄上清液,加入新培養(yǎng)液:棄去上清液,加入2ml培養(yǎng)液,用滴管輕輕吹打細胞制成細胞懸液。

(四)分裝稀釋細胞

1.分裝:將細胞懸液吸出分裝至2-3個培養(yǎng)瓶中,加入適量培養(yǎng)基旋緊瓶蓋。

2.顯微鏡下觀察細胞:倒置顯微鏡下觀察細胞量,必要是計數(shù)。注意密度過小會影響傳代細胞的生長,傳代細胞的密度應該不低于5×105/ml。最后要做好標記。

(五)繼續(xù)培養(yǎng)

用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶,適當旋松瓶蓋,放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代細胞2小時后開始貼附在瓶壁上。當生長細胞鋪展面積占培養(yǎng)瓶底面積25%時為一個+,占50%為++,占75%時為+++。

在細胞培養(yǎng)過程中,支原體感染發(fā)生率達到63%,因而細胞培養(yǎng)過程中被支原體污染是一個世界性的難題。細胞培養(yǎng)中常遇見的有細菌污染、真菌污染、支原體污染、病毒污染等。說起支原體污染,估計細胞培養(yǎng)的同學就開始犯愁了,細胞培養(yǎng)的老手都知道,支原體污染非常不易察覺。有的實驗室被支原體污染后,如果不進行有效*的支原體清除,該實驗的細胞培養(yǎng)很難進行下去,細胞傳代3代以后狀態(tài)就急劇下滑,無法進行正常實驗,有的實驗室甚至只能指望換細胞間。那么怎樣才能有效檢測并清除支原體污染呢?

有沒有什么方法能夠簡單高效地祛除DNA污染呢?


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當然有:Minerva Biolabs PCR Clean™

通過中和以及降解的原理,可快速有效地祛除任何物體表面的DNA、RNA以及DNA酶、RNA酶的污染,使它們快速的降解,從而確保PCR實驗結(jié)果的準確。

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將PCR Clean™噴在操作臺表面,反應1分鐘后,即可用干凈紙巾擦干試劑。

注:如果沒有擦拭干凈,液體揮發(fā)后表面可能有白色殘留,影響美觀。此時可用噴壺噴灑蒸餾水到白色殘留處,然后擦拭即可。

針對移液器需要去除DNA污染,可按照說明書拆開移液器,將桿軸浸泡在PCR Clean™噴霧劑中,1分鐘后取出后用水沖洗,晾干,重新組合。


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