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Real-time PCR的簡介和應用

更新時間:2023-07-23  |  點擊率:718

實時聚合酶鏈式反應(Real-time PCR,RT-PCR)是一種高效、靈敏且廣泛應用于分子生物學和醫(yī)學研究的技術(shù)。它結(jié)合了傳統(tǒng)PCR技術(shù)和熒光探針的使用,使我們能夠?qū)崟r監(jiān)測PCR反應過程中目標DNARNA的擴增量,從而可以準確快速地定量分析樣本中的特定分子。

 

RT-PCR的工作原理非常簡單,它包括三個主要步驟:逆轉(zhuǎn)錄、PCR擴增和熒光檢測。

 

首先,通過逆轉(zhuǎn)錄酶(Reverse Transcriptase)的作用,將RNA逆轉(zhuǎn)錄成其對應的cDNA(復制的DNA)。這一步允許我們將RNA樣本轉(zhuǎn)化為DNA,從而方便后續(xù)的PCR擴增分析。

 

接下來,將逆轉(zhuǎn)錄后得到的cDNA用作PCR的模板。通過加入特定的引物(primers)和熒光探針(例如TaqMan探針或SYBR Green探針),我們可以選擇性地擴增和檢測感興趣的目標序列。

 

PCR反應過程中,熒光探針與PCR產(chǎn)物結(jié)合,并釋放出熒光信號,這個信號的強度與目標序列的起始數(shù)量成正比。利用實時PCR儀器,我們可以實時監(jiān)測這些熒光信號的累積,從而獲得PCR反應的實時擴增曲線。通過分析擴增曲線,我們可以確定樣本中目標分子的起始數(shù)量,并進一步比較不同樣本之間的相對表達水平。

 

RT-PCR在許多研究領(lǐng)域得到了廣泛應用:

 

基因表達分析:RT-PCR可用于研究基因在不同組織、細胞類型或治療條件下的表達水平。這有助于了解基因在生理和病理過程中的功能和調(diào)控機制。

 

病毒檢測:RT-PCR是許多病毒檢測的主要方法,包括感病毒、HIV等。它可以快速、準確地檢測病毒的存在,并用于臨床診斷和流行病學研究。

 

微生物學研究:RT-PCR可用于檢測和定量微生物的存在,例如細菌、真菌和寄生蟲等。這對于了解微生物的種類和數(shù)量在感染和疾病中的作用至關(guān)重要。

 

癌癥診斷:RT-PCR在癌癥診斷中也有廣泛應用。通過檢測腫瘤標志物的表達水平,可以幫助早期發(fā)現(xiàn)癌癥并監(jiān)測治療效果。

 

總結(jié)起來,實時聚合酶鏈式反應(RT-PCR)是一種高效、靈敏且廣泛應用的分子生物學技術(shù)。它在基因表達分析、病毒檢測、微生物學研究和癌癥診斷等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展,RT-PCR在醫(yī)學和生物學研究中將繼續(xù)扮演關(guān)鍵的角色,并為科學家們提供強大的工具來深入研究和理解生命的奧秘。

 

在進行分子實驗前,需要對實驗環(huán)境進行清潔。在PCR實驗室中,DNA污染很難清除。即使只有一個污染的DNA分子被檢測到,也會使整個PCR檢測過程出現(xiàn)誤差。為確保PCR試驗數(shù)據(jù)準確,預防DNARNA交叉污染,PCR實驗室大多會常備DNA/RNA污染清除劑。

祛除DNA污染噴霧劑(實驗環(huán)境用)——PCR-Clean,可有效地降解大多數(shù)表面上(輕質(zhì)金屬或有色金屬除外)的擴增子,質(zhì)粒或基因組DNARNA。該產(chǎn)品還能有效地去除DNA酶和RNA酶。     


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