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科學的『支原體標準品』使用方法,讓檢測結果更靈敏

更新時間:2024-04-29  |  點擊率:411

《歐洲藥典》第2.6.7章(EP 2.6.7)以及《日本藥典》第G3章(JP G3),詳細描述了如qPCR等方法、基于核酸擴增技術(NAT)的支原體檢測。這些藥典中指出,如果需要用NAT法替代傳統(tǒng)方法,要求顯示每毫升樣品體積(CFU/ml)10個菌落形成單位的檢測,即靈敏度達到10CFU/ml。這種靈敏度驗證是方法驗證的一條必經(jīng)之路。

 

然而,由于一些細胞培養(yǎng)實驗室、研究機構、生產(chǎn)線不配備符合支原體培養(yǎng)條件的標準化微生物實驗室,很難實現(xiàn)在實驗室中培養(yǎng)或處理活的、用于靈敏度測試的支原體菌落。10CFU靈敏度標準品(不可逆滅活的支原體)便應運而生。為了保障滅活菌株的使用效果,德國Minerva Biolabs潛心研制,將先進的凍干粉技術用于支原體檢測標準品的生產(chǎn)過程中,盡可能保障在運輸過程中不破壞其生物活性,能夠幫助科研人員實現(xiàn)更高靈敏度的檢測驗證。

 

產(chǎn)品雖好,但也需要配合科學的使用方法才能事半功倍。本期內(nèi)容,我們就來一起探討,支原體檢測標準品的科學使用方法。

 

一、標準品的溫度平衡

標準品在不同溫度下,可能會表現(xiàn)出不同的特性,忽略溫度平衡可能會導致實驗結果的不穩(wěn)定性。

因此,在復溶前需對標準品進行溫度平衡處理,以降低因溫度突變引起的損壞或變性的可能性,使標準品溫度逐漸接近溶解時的溫度,減少溫度變化造成的不良影響,避免基質(zhì)溫度過低導致凍干粉溶解困難,保證標準品在復溶過程的穩(wěn)定性和活性,提高實驗靈敏度。

具體做法是,在復溶前,需要將標準品從2-8℃環(huán)境中轉移至室溫環(huán)境下,對其進行溫度平衡,待所有成分與室溫一致時,才可進行下一步操作。

 

溫度平衡好后,將標準品放入低速離心機內(nèi),短暫離心,通過旋轉,將附著在管壁的凍干粉末甩至瓶底,保障復溶后物質(zhì)濃度穩(wěn)定。

 

小心打開標準品離心管,沿管壁向每個離心管中,加入經(jīng)過室溫平衡的待檢樣品的同款基質(zhì)1ml,室溫孵育5分鐘。不建議用移液器反復吹打,容易造成試劑的浪費。孵育好后,可以漩渦10,然后再低速離心機內(nèi)旋轉5秒,將管壁的液體甩下去。

 

二、支原體標準品DNA提取與擴增

滅活支原體含有一部分膽固醇和脂質(zhì),對核酸擴增實驗會造成不同程度的影響。因此,在檢測前,需要對支原體標準品進行DNA提取,以純化標準品中的DNA并去除可能存在的 PCR 抑制物質(zhì),從而提高PCR反應的靈敏度和特異性。此外,經(jīng)過提取的支原體DNA更容易被PCR擴增,因為純化后的DNA更容易與引物結合,并且不易受到來自樣品基質(zhì)的干擾。推薦使用配套的Venor®GeM Sample Preparation Kit支原體提取試劑盒(貨號:56-1010)。

根據(jù)提取試劑盒的要求,取適量標準品溶液進行DNA提取,隨后再進行正式的qPCR檢測實驗。

 

三、支原體標準品DNA分裝與儲存

 

很多實驗人員習慣將用不完的標準品試劑,在復溶后進行冷藏或冷凍儲存,其實這樣的操作會在很大程度上,降低標準品的生物活性,影響檢測的靈敏度,主要影響因素有以下幾點:

1、降低標準品的生物活性:反復凍融會導致支原體標準品中核酸等分子結構發(fā)生變化或損壞,降低了標準品的活性、影響其穩(wěn)定性。這些變化可能會在標準品的后續(xù)使用過程中,導致實驗結果出現(xiàn)較大波動,影響實驗結果的準確性。

2、污染風險增加:反復凍融會增加標準品接觸外界環(huán)境的機會,提高了諸如細菌、真菌等微生物污染,或者其他化學物質(zhì)的潛在的污染風險。

 

因此,為了確保支原體標準品的活性、穩(wěn)定性和準確性,我們建議,盡量在復溶后將溶液一次性全部用完,以避免反復凍融帶來的潛在負面影響。

 

另外需要注意的是,在任何情況下,都不建議將使用前、還未復溶的標準品進行冷凍保存。

相關人員的研究顯示,在2-8℃環(huán)境中,德國MB公司的凍干粉狀態(tài)穩(wěn)定,在有效期內(nèi)保存得當?shù)那闆r下均可放心使用,是一種經(jīng)濟實惠又穩(wěn)健的儲存方式。

如果將凍干粉置于-20℃環(huán)境下,可能會使水分重新進入粉末中,導致標準品重新溶解。這個過程中,支原體標準品的結構和活性也會受到影響,從而降低其可靠性和有效性。此外,冷凍過程中可能會引起凍融循環(huán),導致支原體標準品穩(wěn)定性下降,影響其在實驗中的使用效果。

 


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