病毒檢測Kit  （RT-qPCR法）

ConviFlex™ RT-Taq Mix

一、產(chǎn)品用途：
病毒檢測Kit  （RT-qPCR法））（英文名：ConviFlex RT-Taq Mix）用于定性檢測和分析RNA病毒和RNA分子，特別適合檢測等此類病毒。

二、產(chǎn)品描述：
1. 該試劑盒為實時定量qPCR（RT-qPCR）RNA病毒檢測試劑盒。

2. 試劑盒由兩種組分組成：

組分1.  ConviFlex™ RT-Taq Mix的凍干粉包含：MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq聚合酶及dNTP。
其中MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶，來自小鼠白血病病毒（M-MuLV）并經(jīng)過基因修飾。
這里的Taq聚合酶另兼具熱啟動功能。
此Taq酶在室溫下，活性被抗體所抑制，當溫度達到70°C以上時，才會被*激活。
在70°C 以下時，由于Taq酶沒有*活化，因此實驗不會產(chǎn)生非特異性PCR產(chǎn)物和引物二聚體。熱啟動Taq酶的使用可使PCR具有更高的特異性和靈敏度。

3. 試劑盒使用時，先用復溶緩沖液溶解凍干粉，再加入自備的RNA模板和引物。
推薦使用MB公司提供的引物/探針（英文名：SARS-CoV-2 Confirm，
貨號271-2100）

4. 該試劑盒適合大多數(shù)RT-qPCR體系和qPCR儀類型。關于實驗使用的最佳體積、濃度、溫度和孵育時間，本文有相應的建議，但實驗室仍可依據(jù)自己的分析要求作相應調(diào)整。

三、產(chǎn)品特點：
1. 凍干粉為逆轉(zhuǎn)錄酶和Taq酶的預混液，將RNA逆轉(zhuǎn)錄與qPCR擴增兩個過程合并，一步完成，減少移液次數(shù)、避免交叉污染、操作簡單，節(jié)約時間。
2. Taq酶具有70°C熱啟動功能，顯著提高試劑盒的特異性和敏感度。
3. 主要組分為凍干粉，4℃保存，儲存運輸方便，性能穩(wěn)定。

四、需用戶自己準備的試劑耗材和儀器：

1. 引物、探針（可選）
推薦MB公司提供的引物/探針（英文名：SARS-CoV-2 Confirm，
貨號271-2100）
2. 熒光定量PCR儀（qPCR儀）
3. 無DNase和RNase的qPCR反應管
4. 離心機
5. 移液器及帶濾芯吸頭（不含DNase和RNase）
6. 用戶自己的樣品。

五、樣本制備說明：
1. 來自于真核細胞、原核細胞、病毒的RNA以及體外轉(zhuǎn)錄的RNA，均可用于檢測。
2. 制備的RNA必須不含RT-qPCR抑制劑，例如有機溶劑等。
3. 盡量減少RNA樣品的凍融次數(shù)，同時避免RNA酶污染，以減少RNA降解的風險。（RNA降解會極大地限制了RT-qPCR反應的性能）
4. 樣本制備過程中，注意避免其他DNA的污染，DNA的干擾也會降低qPCR的準確性。
建議采用商品化的RNA提取試劑盒預先處理待檢物（如拭子、活檢組織、哺乳動物細胞和細菌），例如MB廠家的
【RNA小提試劑盒】（英文名：ExtractNow™ RNA Mini Kit，貨號603-1050）
【病毒RNA提取試劑盒】
(英文名：ExtractNow™ Virus RNA Kit, 貨號611-1010/-1050/-1250)

或使用其他已建立的方法。

六、操作注意事項：
該試劑盒應僅由經(jīng)過培訓的實驗室人員使用。始終穿上合適的防護服和戴一次性手套。
根據(jù)樣品類型，應謹慎處理所有樣品。 該試劑盒不含有害物質(zhì)。殘余物可以根據(jù)當?shù)胤ㄒ?guī)丟棄。

七、操作步驟
步驟1. 凍干粉ConviFlex™RT-Taq Mix，最大速離心5秒鐘，然后加入260μl復溶緩沖液2×Rehydration Buffer，室溫靜置5分鐘后，渦旋并離心5秒鐘，分裝，待用或-18℃保存。

步驟2.  每個反應體系為20µl，其中反應mix為15µl。
（1）依據(jù)本次試驗樣本數(shù)，制備RT-qPCR的反應mix。
1個反應mix需要：
①ConviFlex™ RT-Taq Mix（即上面復溶的預混液）10µl，
②引物（濃度0.1 - 0.5 µM）
③探針（濃度0.1 - 0.5 µM）
④PCR級水（使每管總體積為15µl）
注：引物和探針的推薦濃度范圍是0.1-0.5 μM。
通常，引物濃度過高，會增加引物錯配和非特異RT-PCR產(chǎn)物。然而，當RT-PCR程序運行時間較長或使用簡并引物時，則推薦引物濃度升高至1 μM。（注意：若使用簡并引物，同一RT-PCR分析中，引物之間應具有相同的熔解溫度）
（2）將反應mix渦旋并離心5秒鐘。
（3）每個PCR管中加入15μl反應mix和5μl樣本（抽提后的RNA），
或5μl RNA提取試劑盒中的洗脫緩沖液，作為陰性對照，或5μl PCR級水作為無模板對照，或5μl陽性對照。
（4）扣緊PCR管，然后短暫離心。
（5）將PCR管放置qPCR儀上，蓋好蓋。

步驟3. 在qPCR儀上設置反應程序，
示例:  1 cycle   50 °C for 20 min
1 cycle   95 °C for 10 min
45 cycles 95 °C for 15 sec
60 °C for 1 min
   (以上程序僅依據(jù)廠家經(jīng)驗，用戶可根據(jù)實際情況調(diào)整溫度和孵育時間)

步驟4. 啟動程序

八、使用注意事項：
1.使用前應認真閱讀說明書。
2.來自不同批次的試劑不能混合。
3.試劑盒內(nèi)的試劑應始終作為一個整體溶解分裝。
4.試劑盒應在效期內(nèi)使用。
5.每次PCR至少應設置一個陽性對照。每次PCR至少應設置一個陰性對照和/或一個無模板對照。如果實驗者自己抽提RNA，則可使用洗脫緩沖液作為陰性對照。對照必須與待測樣品的處理方式相同。您也可能需要其他實驗室提供的對照品，例如含高、中、低不同濃度的RNA樣品。使用對照，對于確認結(jié)果的可靠性或用于排除故障非常有意義。
6.建議在無RNA和DNA污染的條件下進行RT-PCR，以避免操作過程中DNA或非特異RNA的交叉污染。（MB公司推薦使用PCR污染祛除噴霧，英文名：PCR Clean™，貨號15-2025，預先清潔實驗環(huán)境。）
7.RNA模板濃度，應依據(jù)提取RNA的質(zhì)量、來源、感興趣基因的相對豐度、以及是否為低拷貝基因，來調(diào)整優(yōu)化。
8.該試劑盒建議逆轉(zhuǎn)錄步驟的溫度為50°C。但這個溫度及持續(xù)時間可根據(jù)實驗室自己的分析要求進行優(yōu)化，以增強反應的性能。

九、其他相關試劑