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如何判斷知道細(xì)胞被支原體污染了?

更新時(shí)間:2022-07-15  |  點(diǎn)擊率:623

發(fā)生污染,既耽誤時(shí)間又是一個(gè)災(zāi)難,熟練的無菌操作能避免許多問題,但早期檢測(cè)污染是一種可以預(yù)警的方法。對(duì)于培養(yǎng)箱中的每瓶細(xì)胞都要注意觀察,要養(yǎng)成習(xí)慣,每次打開培養(yǎng)箱時(shí),迅速看看有沒有發(fā)生污染。

細(xì)菌、酵母、真菌、霉菌、支原體以及其他的培養(yǎng)細(xì)胞都可能引起污染。

怎樣識(shí)別污染

一、肉眼觀察,把培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿拿起來,對(duì)著光線檢查。

  • 渾濁情況。即使細(xì)胞密度很高,培養(yǎng)基也應(yīng)該是透明的。輕輕移動(dòng)或晃動(dòng)培養(yǎng)瓶,觀察培養(yǎng)基的渾濁或懸浮情況,一些霉菌可能會(huì)在培養(yǎng)基的表面形成菌落。

  • 培養(yǎng)基顏色的變化。酸性條件下,加了酚紅的培養(yǎng)基會(huì)由紅變黃,而堿性條件下會(huì)變成紅紫色。細(xì)菌污染常常會(huì)使培養(yǎng)基變成黃色,真菌污染會(huì)使培養(yǎng)基變成深紫紅色。

  • 聞!當(dāng)然不能打開瓶子去聞,把鼻子貼在瓶口聞,許多污染發(fā)生以后都會(huì)散發(fā)出易察覺的、特殊的氣味,甚至一打開培養(yǎng)箱門就聞到了。

二、顯微觀察。在倒置顯微鏡下,先用低倍(10 X) 再用高倍(40 X) 物鏡(總放大倍數(shù)為400) 觀察細(xì)胞培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞:

  • 其他有機(jī)體。在低倍鏡下,真菌的菌絲體成長(zhǎng)棒狀,并橫穿整個(gè)視野,還可以觀察到酵母,有時(shí)呈小圓球形,有時(shí)還有芽。

在高倍鏡下可以觀察到細(xì)菌,它們可能是棒狀或球狀,單獨(dú)成鏈或成團(tuán)存在,它們也可能和細(xì)胞混在一起,并且明顯處于細(xì)胞內(nèi)部,有些細(xì)胞可能已經(jīng)裂解變得模糊。觀察時(shí)可能每?jī)蓚€(gè)視野才出現(xiàn)一個(gè)污染(當(dāng)然也算被污染了!),而且可能污染物是可以運(yùn)動(dòng)的。

  • 損傷細(xì)胞。感染會(huì)殺死細(xì)胞,可能導(dǎo)致每個(gè)細(xì)胞都裂解和/或細(xì)胞層從附著物上*剝離,更可能的是細(xì)胞變得不規(guī)則(或大或?。?,在低倍鏡下是黑色的粒狀

懸浮培養(yǎng)細(xì)胞比貼壁培養(yǎng)細(xì)胞更加難以顯微觀察,尤其是高倍顯微鏡下。

  • 將培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿放在顯微鏡的載物臺(tái)上,靜置一會(huì)。

  • 將焦距對(duì)準(zhǔn)器皿的底部,觀察那些輕微附著的細(xì)胞,因?yàn)樗鼈兛赡芤呀?jīng)接觸到了微生物。

  • 對(duì)準(zhǔn)整個(gè)培養(yǎng)瓶焦距,當(dāng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的時(shí)候,用細(xì)聚焦調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)節(jié),仔細(xì)檢查周圍的培養(yǎng)基有沒有污染發(fā)生。

如果你不能確定是否發(fā)生了污染

  • 制作濕涂片或染色片。取1 ml 培養(yǎng)基離心,用50 μl 培養(yǎng)基或緩沖液重新懸浮細(xì)胞,滴一滴到載玻片,蓋上蓋玻片制成濕涂片;或涂片、固定并染色(甲基蘭或革蘭氏染液),在高倍鏡下觀察。

  • 將細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基或瓊脂培養(yǎng)基上劃線, 37℃培養(yǎng)3 天。如果有菌落,那么細(xì)胞被污染了。

  • 取1 ml 的細(xì)胞培養(yǎng)液至無菌的微量離心管中, 37℃培養(yǎng)3 天。觀察到渾濁物,做濕涂片顯微鏡觀察。

 

Mynox®殺除支原體功能強(qiáng)大有效,但價(jià)格較貴。

方法三:對(duì)于已耗費(fèi)很多時(shí)間,大量擴(kuò)增起來的細(xì)胞,或經(jīng)過基因轉(zhuǎn)染、體外刺激等大量工作處理過的細(xì)胞,如果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞被支原體污染了,怎么辦?此時(shí)由于前期工作量巨大,使操作人員無法丟棄已有細(xì)胞。

但由于價(jià)格原因,又無法使用方法二提到的昂貴試劑殺除細(xì)胞上的支原體,

同時(shí),實(shí)驗(yàn)人員還需要清除細(xì)胞上的支原體污染,讓實(shí)驗(yàn)得以往下推進(jìn),以最終獲得準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

此時(shí),實(shí)驗(yàn)者可選用對(duì)支原體有效的抑制劑,通過對(duì)細(xì)胞的前期處理,中期加藥,逐步通過4代左右的培養(yǎng),得以將支原體污染*清除,確保試驗(yàn)順利推進(jìn),結(jié)果準(zhǔn)確。

此類試劑眾多,筆者周圍的實(shí)驗(yàn)人做過很多嘗試,其中效果最確切且性價(jià)比較高的當(dāng)屬德國(guó)Minerva公司的ZellShield®祛除劑。

它的原理是:通過抑制支原體增殖中DNA和蛋白的合成,達(dá)到抑制新的支原體增殖的目的。屬?gòu)?fù)合型的新型抗生素。

注:使用ZellShield®時(shí),不需使用鏈青霉素。

 

操作步驟:

第一步:研究發(fā)現(xiàn),98%的支原體污染發(fā)生在細(xì)胞間隙。因此,首先要把細(xì)胞消化下來,放入離心管,懸浮沖洗,離心,棄上清,反復(fù)三次。此時(shí)可將細(xì)胞上大部分的支原體去除,為進(jìn)一步加藥抑制做好準(zhǔn)備。

第二步:培養(yǎng)液中加入1%的ZellShield®,細(xì)胞進(jìn)行正常培養(yǎng)。新的支原體增殖受到抑制,舊的支原體隨著細(xì)胞的換液逐步減少,通過4代左右的培養(yǎng),細(xì)胞中的支原體基本可被*清除。

 

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