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如何從樣品預(yù)處理角度,提高支原體檢測的準(zhǔn)確性

更新時間:2024-03-27  |  點擊率:494

支原體放行檢測,在臨床相關(guān)的項目中發(fā)揮著重要作用。常見的一些研究,如干細(xì)胞治療項目、免疫細(xì)胞治療項目研究、CAR-T項目研究、抗體藥研究、疫苗等領(lǐng)域,以及還有一些重要的細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞典藏項目,都需要對培養(yǎng)的細(xì)胞或收獲的產(chǎn)物,進行準(zhǔn)確度較高的支原體檢測,以保證產(chǎn)物沒有支原體污染。?

 

qPCR法是十分常用的支原體檢測方法。藥典中指出,通過方法學(xué)驗證,即在檢測限、特異性和耐用性等方面達(dá)到要求后,才能替代傳統(tǒng)的檢查方法。因此,qPCR實驗的結(jié)果的穩(wěn)定性與精準(zhǔn)度,直接關(guān)系到方法學(xué)驗證是否可信。

 

除了實驗操作、所選擇的試劑盒等常見的影響因素,待檢樣品的預(yù)處理方法,也會對qPCR檢測結(jié)果造成不同程度的影響。

 

用于支原體檢測的樣品的成分通常比較復(fù)雜,可能存在抑制PCR的物質(zhì),影響qPCR實驗的結(jié)果。在進行qPCR檢測之前,需要將樣品中的支原體DNA純化出來,以確保檢測的準(zhǔn)確性和靈敏度。

 

進行DNA提取的優(yōu)勢:

1、提高檢測的準(zhǔn)確性:DNA提取可以有效地從復(fù)雜樣品中分離出支原體的DNA,避免雜質(zhì)對檢測結(jié)果的干擾,從而提高檢測的準(zhǔn)確性,降低假陽性結(jié)果的可能性。

2、增加檢測的靈敏度:通過DNA提取,可以將支原體的DNA濃縮到較高的水平,使其在qPCR中的檢測限度更低,提高了檢測的靈敏度,即能夠檢測到更低濃度的支原體。

3、節(jié)省成本:雖然DNA提取可能需要一定的時間和成本,但它可以避免由于假陽性結(jié)果而帶來的額外成本,如錯誤的結(jié)果導(dǎo)致方法學(xué)驗證失敗等。

 

因此,當(dāng)待檢樣品如果存在以下幾種情況(包括但不限于),需要對樣品進行DNA提取處理,以提高支原體檢測的靈敏度:

1、細(xì)胞培養(yǎng)基中的血清濃度如果超過12%,那么對下游的PCR反應(yīng)會產(chǎn)生抑制。酚紅,對熒光定量PCR的檢測也會干擾。這些均可以通過使用德國Miverva Biolabs公司的支原體DNA提取試劑盒來解決。

2、對于樣品類型是細(xì)胞團、疫苗、凍存細(xì)胞和石蠟包埋的組織,需要提前提取DNA

3、如果樣品中蛋白含量高于10mg/ml,則先需要用蛋白酶K進行處理,再用原體DNA提取試劑盒提取樣品中的DNA。

 

德國Minerva Biolabs公司生產(chǎn)的Venor®GeM Sample preparation Kit支原體DNA提取試劑盒,可實現(xiàn)支原體檢測方法驗證過程中的樣品制備步驟,包括DNA提取和純化,可防止可能干擾qPCR擴增的污染物或抑制劑的引入。從細(xì)胞上清和生物制品中分離支原體DNA,全程只需30分鐘。該試劑盒的操作分四步:細(xì)胞溶解,DNA特異性與層析柱結(jié)合,祛除殘留的污染物和抑制劑,洗脫DNA。

 

該試劑盒符合歐洲藥典規(guī)范,配合支原體qPCR檢測試劑盒、支原體標(biāo)準(zhǔn)品一起使用,通過歐洲藥典的方法學(xué)驗證,助力新藥上市。


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